METODI PER LA DETERMINAZIONE DI MICRORGANISMI INDICATORI D’INQUINAMENTO E DI PATOGENI 7000 - METODI PER LA DETERMINAZIONE DI MICROORGANISMI INDICATORI DI INQUINAMENTO E DI PATOGENI  M E T O D I P E R L A D E T E R M I N A Z I O N E D I M I C R O R G A N I S M I I N D I C AT O R I D’INQUINAMENTO E DI PATOGENI 7000. Metodi per la determinazione di microorganismi indicatori d’inquinamento e di patogeni Dalla difficoltà di utilizzare tecniche di routine finalizzate alla ricerca di tutti i possibili organismi patogeni, è sorta la necessità di ricercare, per la definizione della qualità di un’acqua, microrganismi indicatori di contaminazione, la cui presenza può essere considerata indice della presenza di patogeni. L’uso degli indicatori tuttavia fornisce la probabilità, e non la certezza, della presenza di patogeni. I microrganismi storicamente proposti come indicatori di inquinamento fecale nell’ambiente e che vengono ricercati, comunemente e su base normativa, per la definizione della qualità di acque di diversa tipologia e a diversa destinazione d’uso sono i Coliformi Totali, i Coliformi Fecali (di cui fa parte Escherichia coli) e gli Streptococchi Fecali. Negli anni più recenti, l’approfondimento degli studi e delle ricerche ha tuttavia orientato l’interesse su altri gruppi di indicatori o specie microbiche più significativi: enterococchi ed Escherichia coli sono attualmente ritenuti più validi indicatori di contaminazione fecale e parametri che, meglio di altri, possono segnalare la eventuale presenza di patogeni. In Tab. 3 vengono suggeriti alcuni volumi iniziali per l’analisi di acque naturali di diversa tipologia per il rilevamento quantitativo degli indicatori di contaminazione fecale. Sorgente x Lago x x Torrente x x Fiume x x Refluo clorata x x trattam. secondario x x x trattam. primario x x grezza x x Tipo di acqua 10 1 0,1 0,01 0,001 Volumi (mL) Tabella 3: Volumi proposti per l’analisi di acque di diversa tipologia per il rilevamento quantitativo degli indicatori di contaminazione fecale La ricerca dei patogeni deve essere effettuata, rispetto agli indicatori, su quantitativi più elevati di acqua, ma, mentre il loro rilevamento testimonia ovviamente della loro sicura presenza, un risultato negativo non depone per la loro sicura assenza. Infatti i patogeni possono essere presenti con discontinuità negli effluenti e conseguentemente nei corpi idrici riceventi; in aggiunta, l’abbondante presenza di flora contaminante accessoria interferisce spesso con la reale possibilità di evidenziare i patogeni anche quando essi siano presenti. Pertanto, a causa della discontinuità della loro presenza e delle difficoltà tecniche legate al loro isolamento nell’ambiente idrico, la ricerca dei patogeni non potrà tanto avere il significato di controllare la qualità delle acque, quanto finalità epidemiologiche, offrendo la possibilità di individuare uno degli anelli della catena attraverso la quale avviene la diffusione degli agenti patogeni responsabili delle malattie infettive di origine idrica. Di seguito vengono presentati i metodi di analisi per la ricerca sia di indicatori di contaminazione fecale (coliformi, streptococchi ed Escherichia coli) e di qualità (conteggio delle co  METODI PER LA DETERMINAZIONE DI MICRORGANISMI INDICATORI D’INQUINAMENTO E DI PATOGENI lonie su agar), sia di alcuni organismi che producono forme di resistenza (spore di clostridi solfito-riduttori, uova di Elminti), di patogeni e opportunisti patogeni di natura batterica (Salmonella, Vibrio e Aeromonas), batteriofagi, virus e protozoi patogeni. I metodi proposti per i diversi parametri microbiologici considerati sono stati elaborati in rispetto delle più recenti acquisizioni tecnico-scientifiche e degli aggiornamenti che in questi anni sono stati segnalati a livello nazionale ed internazionale. Sono pertanto stati inseriti metodi analitici che, sperimentati ampiamente in laboratorio e facenti parte di protocolli operativi per la ricerca dei parametri microbiologici presi in considerazione, erano già stati proposti da enti ed organizzazioni internazionali quali ISO, APHA, USEPA, AOAC, PHLS, WHO. Alcuni di essi fanno già parte di una serie di metodi di riferimento proposti a livello nazionale dall’Istituto Superiore di Sanità, dall’IRSA e dal Ministero delle Politiche Agricole e Forestali. Ancora, alcuni sono stati sottoposti a prove di comparazione tra metodi anche nell’ambito di circuiti interlaboratoriali svolti a livello europeo. Per quanto riguarda le attrezzature di laboratorio, le tecniche di campionamento e quelle di analisi più generali, si fa riferimento alle Sezioni 6020, 6030 e 6040.  METODI PER LA DETERMINAZIONE DI MICRORGANISMI INDICATORI D’INQUINAMENTO E DI PATOGENI 7010. Coliformi totali 1. Introduzione 1.1 Generalità Nel gruppo dei coliformi totali vengono compresi microrganismi che fanno parte della famiglia delle Enterobacteriaceae. L’appartenenza a questa famiglia da parte di generi differenti, più che sulle caratteristiche sistematiche dei diversi microrganismi, si è basata storicamente sul metodo utilizzato per il loro rilevamento che sfrutta la loro capacità di fermentare il lattosio con produzione di gas e acido alla temperatura di 35°-37°C in 48 ore. I coliformi totali sono batteri a forma di bastoncello, gram negativi, aerobi ed anaerobi facoltativi, non sporigeni. Sono considerati, insieme ai coliformi fecali e agli streptococchi, classici indicatori di contaminazione nelle acque. Pur essendo presenti nel materiale fecale di origine umana con una densità media di 109 UFC/g, sono ubiquitari. Proprio a causa della loro costante presenza nell’ambiente, la loro validità come indicatori è stata più volte messa in dubbio. Le più recenti indicazioni, in fase comunque di ulteriore evoluzione, tendono a distinguere i microrganismi appartenenti al gruppo in due principali categorie che, in base alle specie, e non più al genere, differenziano coliformi di origine fecale e coliformi di origine acquatica e tellurica, naturalmente presenti nelle acque al di là di qualsiasi contaminazione. La prima categoria, ben conosciuta, è quella dei coliformi di riconosciuta origine fecale che comprende alcune specie dei generi Escherichia, Enterobacter, Citrobacter e Klebsiella, presenti nel materiale fecale del- l’uomo e degli animali a sangue caldo e in acque e suoli contaminati. La seconda categoria corrisponde a specie che, al contrario, sono largamente distribuite nell’ambiente, dove possono anche moltiplicarsi, colonizzando suolo, acqua e vegetazione. Nelle acque reflue grezze le loro concentrazioni possono raggiungere valori compresi tra 107109per 100 mL di campione. 1.2 Obiettivo Il metodo consente di valutare, in un volume noto di acqua, la concentrazione dei microrganismi appartenenti al gruppo dei coliformi totali. 1.3 Principio del metodo La procedura analitica si basa sul conteggio dei microrganismi presenti in un volume noto del campione di acqua. Possono essere utilizzate due tecniche analitiche: - Metodo A: metodo del numero più probabile o dei tubi multipli (MPN). Con questo metodo, che consiste in una prova presuntiva e in una prova di conferma, viene calcolata la densità dei coliformi totali in campioni di acqua tramite una stima statistica determinata sulla base della combinazione di tubi positivi e negativi ottenuti inoculando aliquote del campione in terreno colturale liquido. Il risultato può essere ricavato, in base alle diverse combinazioni, dall’apposita tabella già predisposta (Tab. 1, Sezione 6020). Di seguito viene riportata la descrizione del metodo e vengono indicati, per la prova presuntiva, due terreni di coltura alternativi che si basano sulla fermentazione del lattosio. - Metodo B: metodo della filtrazione su membrana (MF). Questo metodo per865  METODI PER LA DETERMINAZIONE DI MICRORGANISMI INDICATORI D’INQUINAMENTO E DI PATOGENI mette di contare il numero delle colonie cresciute su una membrana posta su terreno colturale agarizzato. Di seguito viene riportata la descrizione del metodo e vengono indicati tre substrati alternativi. 1.4 Campo di applicazione La procedura analitica viene utilizzata per acque superficiali, di fiume, di lago e per acque reflue anche sottoposte a trattamento. 2. METODO A. Metodo del numero più probabile o dei tubi multipli (MPN) Con questo metodo viene calcolata la densità dei coliformi totali in campioni di acque tramite la formula probabilistica che definisce il numero più probabile di batteri coliformi necessario a produrre combinazioni di tubi positivi e negativi in repliche di diluizioni decimali. Il metodo è particolarmente adatto per l’esame di acque che presentano un’elevata torbidità. 2.1 Volume da analizzare Per l’analisi è necessario determinare il volume in base alla tipologia e alla qualità dell’acqua da esaminare. Per acque reflue o comunque di bassa qualità generalmente è necessario analizzare diluizioni scalari del campione; mentre per acque già sottoposte a trattamento possono essere analizzate diluizioni minori e comunque aliquote diverse. 3. Strumentazione e vetreria Normale attrezzatura di laboratorio. 4. Reattivi e terreni di coltura 4.1 Brodi per lo svolgimento della prova presuntiva 4.1.1 Brodo Lattosato Composizione: Estratto di carne 3 g Peptone 5 g Lattosio 5 g Acqua distillata 1000 mL pH 6,9±0,2 Il terreno si trova anche in commercio in forma disidratata e si prepara secondo le istruzioni della ditta produttrice. Dopo avere sciolto la polvere e prima della sterilizzazione, distribuire il terreno in tubi contenenti la campanella di Durham in posizione rovesciata. Conservare il terreno sterilizzato, pronto per l’uso, per non più di 2 settimane a temperatura ambiente in condizioni ottimali. 4.1.2 Brodo al Lauril Triptosio Il terreno può essere utilizzato in alternativa al Brodo Lattosato (4.1.1). Si trova anche in commercio in forma disidratata e si prepara secondo le istruzioni della ditta produttrice. Dopo avere sciolto la polvere e prima della sterilizzazione, distribuire il terreno in tubi contenenti la campanella di Durham in posizione rovesciata. Conservare il terreno sterilizzato, pronto per l’uso, per non più di 2 settimane a temperatura ambiente in condizioni ottimali. 866  METODI PER LA DETERMINAZIONE DI MICRORGANISMI INDICATORI D’INQUINAMENTO E DI PATOGENI Composizione: Triptosio 20 g Lattosio 5 g Dipotassio idrogeno fosfato 2,75 g Potassio diidrogeno fosfato 2,75 g Sodio cloruro 5 g Sodio lauril solfato 0,1 g Acqua distillata 1000 mL pH 6,8±0,2 4.2 Brodo per lo svolgimento della prova di conferma 4.2.1 Brodo Lattosato Bile Verde Brillante Composizione: Peptone 10 g Lattosio 10 g Bile 20 g Verde brillante 13,3 mg Acqua distillata 1000 mL pH 7,2±0,2 Il terreno si trova anche in commercio in forma disidratata e si prepara secondo le istruzioni della ditta produttrice. Dopo avere sciolto la polvere e prima della sterilizzazione, distribuire il terreno nei tubi contenenti la campanella di Durham rovesciata. Conservare il terreno sterilizzato, pronto per l’uso, per non più di 2 settimane a temperatura ambiente in condizioni ottimali. 5. Procedura 5.1 Prova presuntiva Prima di procedere all’inoculo di aliquote scalari del campione nei tubi del brodo per la prova presuntiva (4.1.1 o 4.1.2), agitare vigorosamente il campione per assicurare una distribuzione omogenea dei microrganismi sospesi nell’acqua. Dopo l’inoculo agitare leggermente i tubi e procedere all’incubazione in termostato entro 30 minuti. Incubare a 36±1°C. Dopo 24±2 ore agitare ciascun tubo per verificare la formazione di gas nella campanella ed eventualmente reincubare per altre 24 ore. Alla fine del periodo di incubazione registrare i risultati in base alla disposizione dei tubi che presentano produzione di gas ed intorbidimento del brodo. La produzione di gas entro le 48±3 ore costituisce una reazione positiva presuntiva: sottoporre alla prova di conferma i tubi risultati positivi. 5.2 Prova di conferma Prelevare, sterilmente, 0,1 mL di brodocoltura dai tubi positivi del brodo per la prova presuntiva (formazione di gas entro le 48 ore) ed inoculare nei corrispondenti tubi contenenti il Brodo lattosato bile verde brillante (4.2.1) per la prova di conferma. Incubare i tubi a 36±1°C per 24+24 ore. Alla fine del periodo di incubazione, la formazione di gas nelle campanelle costituisce una reazione positiva per i coliformi totali. Annotare i risultati ottenuti indicando il numero di tubi positivi e negativi e, sulla base delle combinazioni ottenute, consultando la Tab. 1 (vedi Sezione 6020), calcolare, considerando l’eventuale diluizione, il valore dell’indice MPN. 867  METODI PER LA DETERMINAZIONE DI MICRORGANISMI INDICATORI D’INQUINAMENTO E DI PATOGENI 6. Espressione dei risultati Riportare il risultato ottenuto come valore MPN/100 mL di campione. 7. Resoconto di prova Il resoconto di prova deve indicare il metodo utilizzato ed esprimere i risultati come numero più probabile di microrganismi per volume di campione. Deve altresì indicare tutti i dettagli operativi, nonché qualsiasi inconveniente in grado di avere influenzato i risultati. 8. METODO B. Metodo del numero più probabile (MPN) Il metodo di seguito descritto viene riportato nel Manuale “Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater” sotto il nome di Enzyme Substrate Test. L’EPA ha approvato questo tipo di analisi sotto il nome di MMO-MUG test (Colilert). L’AOAC ha inserito il metodo analitico in “Official Methods of Analysis” con il nome di “Defined Substrate Technology” (Colilert). Recentemente la performance del metodo è stata valutata, anche in Italia, durante lo svolgimento di un circuito interlaboratoriale di confronto tra metodi con la collaborazione di diversi laboratori europei. È applicabile all’analisi di acque poco e mediamente contaminate, anche oligotrofe, cloratee comunque contenenti coliformi totali danneggiati. È di facile e rapido impiego. 8.1 Principio del metodo B Il prodotto è già disponibile in commercio sotto forma di kit completo per l’inoculo del campione, utilizzabile in tubi e piastre multi-pozzetto, monouso, per lo svolgimento della tecnica del numero più probabile (MPN). Dopo un periodo di incubazione di 18 o 24 ore a 36±1°C si procede alla lettura dei risultati: i pozzetti positivi per la presenza di coliformi totali hanno virato al giallo. I risultati sono espressi come numero più probabile o Most Probable Number (MPN) per 100 mL di campione. 8.2 Volume da analizzare Il volume da analizzare per qualsiasi tipologia di acque è 100 mL, sia che si tratti del campione tal quale, sia di una sua diluizione, quest’ultima da determinare comunque in base alla tipologia e alla qualità dell’acqua da esaminare. 8.3 Strumentazione e vetreria Per lo svolgimento dell’analisi oltre alla normale attrezzatura di laboratorio sono necessari: -sigillatore automatico.  METODI PER LA DETERMINAZIONE DI MICRORGANISMI INDICATORI D’INQUINAMENTO E DI PATOGENI 8.4 Reattivi e terreni di coltura Composizione: Ammonio solfato 5 g Manganese solfato 0,5 mg Zinco solfato 0,5 mg Magnesio solfato 100 mg Sodio cloruro 10 g Calcio cloruro 50 g Sodio solfito 40 g Amfotericina B 1 mg O-nitrofenil-ß-D-galattopiranoside 0,5 g 4-metilumbellifenil-ß-D-glucuronide 75 mg Solanium 0,5 g Hepes buffer Sali di sodio 5,3 g Acido organico 6,9 g 8.4.1 Defined Substrate Technology (Colilert) Il terreno disidratato viene distribuito in commercio in fiale già predosate per l’esame di 100 mL di campione o di una sua diluizione. Il kit fornisce la possibilità di leggere i risultati dopo 18 o 24 ore. 8.5 Procedura Seguendo le istruzioni della ditta produttrice, mescolare in un flacone sterile il terreno disidratato (8.4.1) con 100 mL di campione o di una sua diluizione. Chiudere il flacone e mescolare per sciogliere completamente il terreno. Attendere che l’eventuale formazione di schiuma sia sparita e versare il contenuto del flacone nella piastra sterile a 51 pozzetti o in quella a 97 pozzetti. Sigillare la piastra inoculata con l’apposito sigillatore automatico (8.3) che provvede anche alla distribuzione del campione all’interno dei pozzetti. 8.5.1 Incubazione Incubare a 36±1°C entrambi i tipi di piastre per un periodo di 18 ore per Colilert 18 e di 24 ore per Colilert. 8.5.2 Lettura e interpretazione dei risultati I pozzetti che hanno virato al giallo sono considerati positivi per i coliformi totali. Senza diluizioni la piastra a 51 pozzetti permette la lettura da 1 a 200 microrganismi/100 mL; la piastra a 97 pozzetti permette la lettura da 1 a 2419 microrganismi/100 mL. 8.6 Espressione dei risultati Riportare il risultato ottenuto come valore MPN/100 mL di campione. I valori dell’indice MPN sono calcolati in base alla tabella specifica fornita con il kit di analisi. 8.7 Resoconto di prova Il resoconto di prova deve indicare il metodo utilizzato ed esprimere i risultati come numero più probabile di microrganismi per volume di campione. Deve altresì indicare tutti i dettagli operativi, nonché qualsiasi inconveniente in grado di avere influenzato i risultati. 869  METODI PER LA DETERMINAZIONE DI MICRORGANISMI INDICATORI D’INQUINAMENTO E DI PATOGENI 9. METODO C. Metodo della filtrazione su membrana (MF) Con questo metodo viene calcolata la concentrazione dei coliformi totali che, presenti in un campione di acqua, sulla superficie di una membrana, posta su terreno di coltura agarizzato, hanno formato colonie tipiche prodotte dai microrganismi ricercati. Di seguito vengono proposti tre substrati di isolamento alternativi. 9.1 Volume da analizzare Per l’analisi è necessario determinare il volume in base alla tipologia e alla qualità dell’acqua da esaminare. Per acque reflue o comunque di bassa qualità generalmente è necessario analizzare diluizioni scalari del campione; mentre per acque già sottoposte a trattamento possono essere analizzate diluizioni minori e comunque aliquote diverse. 9.2 Strumentazione e vetreria Normale attrezzatura di laboratorio. 10. Reattivi e terreni di coltura 10.1. Terreni di isolamento 10.1.1 m-Endo agar (Les) Composizione: Estratto di lievito 1,2 g Casitone 3,7 g Tiopeptone 3,7 g Triptosio 7,5 g Lattosio 9,4 g Potassio diidrogeno fosfato 1,0 g Dipotassio idrogeno fosfato 3,3 g Sodio cloruro 3,7 g Sodio desossicolato 0,1 g Sodio lauril solfato 0,05 g Sodio solfito 1,6 g Fucsina basica 0,8 g Agar 15,0 g Acqua distillata 1000 mL pH 7,2±0,2 Il metodo che utilizza questo substrato è riportato nelle normative nazionali che richiedono la determinazione del parametro coliformi totali per la valutazione della qualità delle acque; pertanto viene necessariamente inserito tra i metodi proposti. Nota: il terreno è classificato come Xn - Nocivo. La scheda di sicurezza, a cui è necessario fare riferimento, informa che la presenza di fucsina basica (Magenta I) comporta la possibilità di effetti irreversibili (R40) e il prodotto può presentare un rischio di cancerogenesi (categoria 1). Il suo utilizzo richiede, da parte degli operatori, particolari precauzioni durante la manipolazione: protezione respiratoria (mascherina antipolvere, o uso di cappa aspirante), protezione delle mani (guanti protettivi), protezione della pelle (indumenti protettivi). Il terreno si trova anche in commercio in forma disidratata e si prepara secondo le istruzioni della ditta produttrice. Non si sterilizza. Dopo avere sciolto la polvere in 1 L di acqua distillata contenente 20 mL di etanolo al 95%, si distribuisce in capsule di Petri. È preferibile pre  METODI PER LA DETERMINAZIONE DI MICRORGANISMI INDICATORI D’INQUINAMENTO E DI PATOGENI parare il terreno al momento dell’uso e comunque, una volta preparato, mantenerlo al riparo dalla luce. L’uso di questo substrato può comportare che coliformi danneggiati dai trattamenti che l’acqua ha subito non vengano rilevati e può permettere la crescita di microrganismi diversi da quelli ricercati. Pertanto può accadere che colonie rosse tipiche non siano formate da microrganismi appartenenti al gruppo dei coliformi totali, così come colonie atipiche possano originare da batteri coliformi. Pertanto, è consigliabile, qualora sorgano dubbi sulla natura delle colonie, sottoporre le colonie sospette a prove di conferma. 10.1.2 C-EC Agar Composizione: Triptosio 10 g Triptofano 1 g Peptocomplesso 5 g Estratto di lievito 3 g Sodio cloruro 5 g Sali di bile n. 3 1,5 g IPTG 0,1 g 5-Br-4Cl-3-indolil-D-galattopiranoside 0,08 g 4-metilumbelliferil-ß-D-glucuronide 0,05 g Agar Bios LL 13 g Acqua distillata 1000 mL pH 6,8±0,2 Il terreno si trova anche in commercio in forma disidratata e si prepara secondo le istruzioni della ditta produttrice. Dopo avere sciolto la polvere sterilizzare a 115±1°C per 15±1 minuti. Distribuire in capsule Petri e lasciare solidificare. Conservare a circa +4°C per non più di 2 settimane in condizioni ottimali. 10.1.3 Chromogenic E.coli/Coliform Medium Composizione: Miscela cromogenica 20,3 g Estratto di lievito 3 g Peptone 5 g Lattosio 2,5 g Sodio cloruro 5 g Sodio fosfato monoacido 3,5 g Potassio fosfato biacido 1,5 g Rosso neutro 0,03 g Agar 15 g Acqua distillata 1000 mL pH 6,8±0,2 Il terreno si trova anche in commercio in forma disidratata e si prepara secondo le istruzioni della ditta produttrice. Dopo avere sciolto la polvere sterilizzare a 121±3°C per 15±1 minuti. Distribuire in capsule Petri e lasciare solidificare. Conservare a circa +4°C per non più di 2 settimane in condizioni ottimali. Il terreno è adatto per la determinazione dei coliformi totali in acque con basse densità di microrganismi interferenti.  METODI PER LA DETERMINAZIONE DI MICRORGANISMI INDICATORI D’INQUINAMENTO E DI PATOGENI 10.2 Substrato di crescita 10.2.1 Agar soia triptone Composizione: Triptone Peptone di soia Sodio cloruro Agar Acqua distillata pH 7,2±0,2 15 5 5 20 1000 g g g g mL Il terreno si trova anche in commercio in forma disidratata e si prepara secondo le istruzioni della ditta produttrice. Dopo avere sciolto la polvere, sterilizzare a 121±3°C per 15±1 minuti. Distribuire in capsule Petri e lasciare solidificare. Conservare a circa +4°C per non più di 2 settimane in condizioni ottimali. 10.3 Reattivo alla Tetrametil-parafenilendiamina dicloridrato 10.3.1 Soluzione di Tetrametil-parafenilendiamina dicloridrato all’1% Composizione: N,N,N’,N’-tetrametil-parafenilendiamina dicloridrato 1 g Acqua distillata 100 mL Dischetti o tamponi adatti all’uopo sono anche disponibili in commercio; in alternativa sciogliere N,N,N’,N’-tetrametil-parafenilendiamina dicloridrato in acqua distillata, preparando la soluzione al momento dell’uso. Nota: è da segnalare che tale prodotto viene classificato come sostanza pericolosa per la salute ai sensi della direttiva 67/548/CEE e successivi adeguamenti. 11. Procedura Filtrare un’aliquota del campione o un volume di una sua diluizione attraverso una membrana di esteri di cellulosa con porosità di 0,45 µm di diametro. Porre la membrana sulla superficie del substrato di isolamento e procedere all’incubazione a 36±1°C per 18-24 ore. 11.1 Lettura dei risultati Dopo incubazione, sul terreno m-Endo Agar (Les) (10.1.1) la lettura dei risultati deve essere effettuata al più presto allo scopo di evitare che la luce provochi alterazioni cromatiche delle colonie cresciute. Sono da considerare coliformi totali le colonie cresciute entro le 24 ore, di colore rosso con riflesso verde metallico. Sul C-EC Agar (10.1.2) sono considerate coliformi totali le colonie di colore verde-blu cresciute entro le 24±2 ore. Sul substrato Chromogenic E. coli/Coliform Medium (10.1.3) sono considerate coliformi totali le colonie di colore rosa cresciute entro le 24±2 ore. È possibile procedere, per la verifica dell’appartenenza alla famiglia delle Enterobatteriacee, a cui il gruppo dei coliformi totali appartiene, alla prova della citocromossidasi (12.1), quale prova di conferma. Eventualmente effettuare l’identificazione delle colonie sospette utilizzando i sistemi miniaturizzati di identificazione biochimica seguendo le indicazioni della ditta produttrice. 872  METODI PER LA DETERMINAZIONE DI MICRORGANISMI INDICATORI D’INQUINAMENTO E DI PATOGENI 12. Conferma biochimica 12.1 Prova della citocromossidasi Prima di effettuare la prova è necessario selezionare, isolando per striscio, le colonie sospette su Agar soia triptone (10.2.1) ed incubare a 36±1°C per 24±2 ore. La prova permette di differenziare i microrganismi appartenenti al gruppo dei coliformi in base alla presenza dell’enzima citocromossidasi. I coliformi sono ossidasi-negativi. 13. Procedura Prelevare, seguendo le usuali regole di asepsi, con un’ansa sterile la colonia cresciuta sul terreno di crescita e strisciare su una carta da filtro imbibita del reattivo (10.3.1) preparato al momento dell’uso o saggiare sui dischetti o con i tamponi adatti all’uopo distribuiti in commercio. Una reazione negativa (tipica dei coliformi totali) si manifesta con il mancato sviluppo di colore, mentre i microrganismi ossidasi-positivi producono una reazione che fornisce una colorazione blu-violetto entro pochi secondi. 14. Espressione dei risultati Il numero di coliformi totali isolati si calcola in base al numero di colonie contate, ed eventualmente sottoposte a conferma, considerando la eventuale diluizione e riportando il valore come Unità Formanti Colonia per 100 mL di campione (UFC/100 mL). Dal numero di colonie caratteristiche contate sulla membrana e tenendo conto dei risultati delle prove di conferma, calcolare il numero di microrganismi presenti in 100 mL del campione in base alla seguente formula (1): A·N·Vs·F C = (1) B·Vt dove: C = numero di colonie che sono state confermate per 100 mL; A = numero di colonie confermate; B = numero di colonie da sottoporre a conferma; N = numero di colonie caratteristiche contate sulla membrana; Vt = volume (mL) di campione analizzato; Vs = volume di riferimento per l’espressione dei risultati (100 mL); F = fattore di diluizione. 15. Resoconto di prova Il resoconto di prova deve indicare il metodo utilizzato ed esprimere i risultati come numero di microrganismi per volume di campione. Deve altresì indicare tutti i dettagli operativi, nonché qualsiasi inconveniente in grado di avere influenzato i risultati.  METODI PER LA DETERMINAZIONE DI MICRORGANISMI INDICATORI D’INQUINAMENTO E DI PATOGENI BIBLIOGRAFIA APHA, AWWA, WEF (1998): “Standard Methods for examination of water and wastewater”, XX Ed., (Washington, APHA). BONADONNA L. (1994): “Coliformi totali sul substrato mEndo: un parametro critico nella routine delle analisi microbiologiche”, Tecnica Sanitaria, 32, 151-159. HAVELAAR A.H., HEISTERKAMP S.H., HOEKSTRA J.A. & MOOIJMAN K.A. (1993): “Performance characteristics of methods for the bacteriological examination of water”, Wat. Sci. Techol. “Technol.”, 97, 1-13.  METODI PER LA DETERMINAZIONE DI MICRORGANISMI INDICATORI D’INQUINAMENTO E DI PATOGENI 7020. Coliformi fecali 1. Introduzione 1.1 Generalità I coliformi fecali o termotolleranti fanno parte di quella frazione di microrganismi appartenenti alla famiglia delle Enterobatteriacee, a forma di bastoncello, gram-negativi, aerobi ed anaerobi facoltativi, non sporigeni che, in base alla definizione basata sulla tecnica della fermentazione, fermentano il lattosio con produzione di gas e acido alla temperatura di 44±1°C in 24 ore. Sono presenti nel materiale fecale ad una concentrazione media di 107-108 UFC/g e possono trovarsi nelle acque reflue grezze a una concentrazione intorno a 105-107 UFC/100 mL. La loro presenza costituisce un indice di contaminazione fecale dell’acqua esaminata. I metodi classici per il loro rilevamento utilizzano una temperatura più elevata come fattore discriminante per distinguerli dai membri del gruppo dei coliformi di origine non fecale. 1.2 Obiettivo Il metodo consente di valutare, in un volume noto di acqua, la concentrazione dei microrganismi appartenenti al gruppo dei coliformi fecali. 1.3 Principio del metodo La procedura analitica si basa sul conteggio dei microrganismi presenti in un volume noto del campione di acqua. Possono essere utilizzate due tecniche analitiche: - Metodo A: metodo del numero più probabile o dei tubi multipli (MPN). Con questo metodo, che consiste in una prova presuntiva e in una prova di conferma, viene calcolata la densità dei coliformi fecali in campioni di acqua tramite una stima statistica determinata sulla base della combinazione di tubi positivi e negativi ottenuti inoculando aliquote diverse del campione in terreno colturale liquido. Il risultato può essere ricavato, in base alle diverse combinazioni, dall’apposita tabella già predisposta (Tab. 1, Sezione 6020). Di seguito viene riportata la descrizione del metodo e vengono indicati, per la prova presuntiva, due terreni di coltura alternativi che si basano sulla fermentazione del lattosio. -Metodo B: metodo della filtrazione su membrana (MF). Questo metodo permette di contare il numero delle colonie cresciute su una membrana posta su terreno colturale agarizzato. Esistono in commercio diversi substrati usati per l’isolamento dei coliformi fecali che garantiscono buoni risultati in fase analitica, anche se non esiste un unico substrato in grado di far crescere tutte le specie presenti. È necessario in ogni caso tenere in considerazione che la scelta di un substrato o di un altro può essere effettuata sulla base dell’esperienza dell’operatore, a condizione che ciò non comporti alcun cambiamento delle caratteristiche di produttività. Di seguito vengono proposti due substrati alternativi.  METODI PER LA DETERMINAZIONE DI MICRORGANISMI INDICATORI D’INQUINAMENTO E DI PATOGENI 1.4 Campo di applicazione La procedura analitica viene utilizzata per acque superficiali, di fiume, di lago e per acque reflue anche sottoposte a trattamento. 2. METODO A. Metodo del numero più probabile o dei tubi multipli (MPN) Con questo metodo viene calcolata la densità dei coliformi fecali in campioni di acque tramite la formula probabilistica che definisce il numero più probabile di batteri coliformi necessario a produrre combinazioni di tubi positivi e negativi in repliche di diluizioni decimali. Il metodo è particolarmente adatto per l’esame di acque che presentano un’elevata torbidità. 2.1 Volume da analizzare Per l’analisi è necessario determinare il volume in base alla tipologia e alla qualità dell’acqua da esaminare. Per acque reflue o comunque di bassa qualità generalmente è necessario analizzare diluizioni scalari del campione, mentre per acque già sottoposte a trattamento possono essere analizzate diluizioni minori e comunque aliquote diverse. 3. Strumentazione e vetreria Normale attrezzatura di laboratorio. 4. Reattivi e terreni di coltura 4.1 Brodi per lo svolgimento della prova presuntiva 4.1.1 Brodo Lattosato Composizione: Estratto di carne 3 g Peptone 5 g Lattosio 5 g Acqua distillata 1000 mL pH 6,9±0,2 Il terreno si trova anche in commercio in forma disidratata e si prepara secondo le istruzioni della ditta produttrice. Dopo avere sciolto la polvere e prima della sterilizzazione, distribuire il terreno in tubi contenenti la campanella di Durham in posizione rovesciata. Conservare il terreno sterilizzato, pronto per l’uso, per non più di 2 settimane a temperatura ambiente in condizioni ottimali. 4.1.2 Brodo al Lauril Triptosio Composizione: Triptosio 20 g Lattosio 5 g Dipotassio idrogeno fosfato 2,75 g Potassio diidrogeno fosfato 2,75 g Sodio cloruro 5 g Sodio lauril solfato 0,1 g Acqua distillata 1000 mL pH 6,8±0,2  METODI PER LA DETERMINAZIONE DI MICRORGANISMI INDICATORI D’INQUINAMENTO E DI PATOGENI Il terreno può essere utilizzato in alternativa al Brodo Lattosato (4.1.1). Si trova anche in commercio in forma disidratata e si prepara secondo le istruzioni della ditta produttrice. Dopo avere sciolto la polvere e prima della sterilizzazione, distribuire il terreno in tubi contenenti la campanella di Durham in posizione rovesciata. Conservare il terreno sterilizzato, pronto per l’uso, per non più di 2 settimane a temperatura ambiente in condizioni ottimali. 4.2 Brodo per lo svolgimento della prova di conferma 4.2.1 EC Medium Composizione: Triptosio 20 g Lattosio 5 g Sali di bile n. 3 1,5 g , Dipotassio idrogeno fosfato 4 g Potassio diidrogeno fosfato 1,5 g Sodio cloruro 5 g Acqua distillata 1000 mL pH 6,9±0,2 Il terreno si trova anche in commercio in forma disidratata e si prepara secondo le istruzioni della ditta produttrice. Dopo avere sciolto la polvere e prima della sterilizzazione, distribuire il terreno in tubi contenenti la campanella di Durham in posizione rovesciata. Conservare il terreno sterilizzato, pronto per l’uso, per non più di 2 settimane a temperatura ambiente in condizioni ottimali. 5. Procedura 5.1 Prova presuntiva Prima di procedere all’inoculo di aliquote scalari del campione nei tubi del brodo per la prova presuntiva (4.1.1 o 4.1.2), agitare vigorosamente il campione per assicurare una distribuzione omogenea dei microrganismi sospesi nell’acqua. Dopo l’inoculo agitare leggermente i tubi e procedere all’incubazione in termostato entro 30 minuti. Incubare a 36±1°C. Dopo 24±2 ore agitare ciascun tubo per verificare la formazione di gas nella campanella ed eventualmente reincubare per altre 24 ore. Alla fine del periodo di incubazione registrare i risultati in base alla disposizione dei tubi che presentano produzione di gas ed intorbidimento del brodo. La produzione di gas entro le 48±3 ore costituisce una reazione positiva presuntiva, sottoporre alla prova di conferma i tubi risultati positivi. 5.2 Prova di conferma Prelevare, sterilmente, 0,1 mL di brodocoltura dai tubi positivi del brodo per la prova presuntiva (formazione di gas entro le 48 ore) ed inoculare nei corrispondenti tubi contenenti il brodo per la prova di conferma (4.2.1). Incubare i tubi a 44±1°C per 24±2ore. Alla fine del periodo di incubazione, la formazione di gas nelle campanelle costituisce una reazione positiva per i coliformi fecali. Annotare i risultati ottenuti indicando il numero di tubi positivi e negativi e, sulla base delle combinazioni ottenute, consultando la Tab. 1 (vedi Sezione 6020), calcolare, considerando l’eventuale diluizione, il valore dell’indice MPN. 6. Espressione dei risultati Riportare il risultato ottenuto come valore MPN/100 mL di campione. 877  METODI PER LA DETERMINAZIONE DI MICRORGANISMI INDICATORI D’INQUINAMENTO E DI PATOGENI 7. Resoconto di prova Il resoconto di prova deve indicare il metodo utilizzato ed esprimere i risultati come numero più probabile di microrganismi per volume di campione. Deve altresì indicare tutti i dettagli operativi, nonché qualsiasi inconveniente in grado di avere influenzato i risultati. 8. METODO B. Metodo della filtrazione su membrana (MF) Con questo metodo viene calcolata la concentrazione dei coliformi fecali che, presenti in un campione di acqua, sulla superficie di una membrana, posta su terreno di coltura agarizzato, hanno formato colonie tipiche prodotte dai microrganismi ricercati. Di seguito sono pro- posti due substrati d’isolamento alternativi. 8.1 Volume da analizzare Per l’analisi è necessario determinare il volume in base alla tipologia e alla qualità dell’acqua da esaminare. Per acque reflue o comunque di bassa qualità generalmente è necessario analizzare diluizioni scalari del campione; mentre per acque già sottoposte a trattamento possono essere analizzate diluizioni minori e comunque aliquote diverse. 9. Strumentazione e vetreria Normale attrezzatura di laboratorio. 10. Reattivi e terreni di coltura 10.1 Terreni di isolamento 10.1.1 m-FC Agar Composizione: Triptosio 10 g Proteose peptone n. 3 o polipeptone 5 g Estratto di lievito 3 g Sodio cloruro 5 g Lattosio 12,5 g Sali di bile 1,5 g Blu di anilina 0,1 g Agar 15 g Acqua distillata 1000 mL pH 7,4±0,2 Il terreno si trova anche in commercio in forma disidratata e si prepara secondo le istruzioni della ditta produttrice. Reidratare in acqua distillata contenente 10 mL di acido rosolico all’1% in NaOH 0,2 N. Non sterilizzare. Conservare il terreno distribuito in capsule Petri a circa +4°C per non più di 2 settimane in condizioni ottimali.  METODI PER LA DETERMINAZIONE DI MICRORGANISMI INDICATORI D’INQUINAMENTO E DI PATOGENI 10.1.2 C-EC Agar Composizione: Triptosio 10 g Triptofano 1 g Peptocomplesso 5 g Estratto di lievito 3 g Sodio cloruro 5 g Sali di bile n. 3 1,5 g IPTG 0,1 g 5-Br-4Cl-3-indolil-D-galattopiranoside 0,08 g 4-metilumbelliferil-ß-D-glucuronide 0,05 g Agar Bios LL 13 g Acqua distillata 1000 mL pH 6,8±0,2 Il terreno si trova anche in commercio in forma disidratata e si prepara secondo le istruzioni della ditta produttrice. Dopo avere sciolto la polvere sterilizzare a 115±1°C per 15±1 minuti. Distribuire in capsule Petri e lasciare solidificare. Conservare a circa +4°C per non più di 2 settimane in condizioni ottimali. 10.2 Substrato di crescita 10.2.1 Agar soia triptone Composizione: Triptone 15 g Peptone di soia 5 g Sodio cloruro 5 g Agar 20 g Acqua distillata pH 7,2±0,2 1000 mL Il terreno si trova anche in commercio in forma disidratata e si prepara secondo le istruzioni della ditta produttrice. Dopo avere sciolto la polvere, sterilizzare a 121±3°C per 15±1 minuti. Distribuire in capsule Petri e lasciare solidificare. Conservare a circa +4°C per non più di 2 settimane in condizioni ottimali. 10.3 Reattivo alla Tetrametil-parafenilendiamina dicloridrato 10.3.1 Soluzione di Tetrametil-parafenilendiamina dicloridrato all’1% Composizione: N,N,N’,N’-tetrametil-parafenilendiamina dicloridrato 1 g Acqua distillata 100 mL Dischetti o tamponi adatti all’uopo sono anche disponibili in commercio; in alternativa sciogliere N,N,N’,N’-tetrametil-parafenilendiamina dicloridrato in acqua distillata, preparando la soluzione al momento dell’uso. Nota: è da segnalare che tale prodotto viene classificato come sostanza pericolosa per la salute ai sensi della direttiva 67/548/CEE e successivi adeguamenti.  METODI PER LA DETERMINAZIONE DI MICRORGANISMI INDICATORI D’INQUINAMENTO E DI PATOGENI 11. Procedura Filtrare un’aliquota del campione o un volume di una sua diluizione attraverso una membrana di esteri di cellulosa con porosità di 0,45 µm di diametro. Porre la membrana sulla superficie del substrato di isolamento e procedere all’incubazione a 44±1°C per 18-24 ore. 11.1 Lettura dei risultati Sul terreno m-FC (10.1.1) i coliformi fecali crescono come colonie blu, ma possono presentare diverse sfumature del colore. Alcuni Escherichia coli possono formare colonie atipiche di colore giallo chiaro. Colonie di colore grigio-crema sono formate generalmente da coliformi non fecali. Sul C-EC Agar (10.1.2) gli stessi microrganismi sviluppano colonie di colore verde-blu. È possibile procedere, per la verifica dell’appartenenza alla famiglia delle Enterobatteriacee, a cui il gruppo dei coliformi fecali appartiene, alla prova della citocromossidasi (12.1), quale prova di conferma. Eventualmente effettuare l’identificazione delle colonie sospette utilizzando i sistemi miniaturizzati di identificazione biochimica seguendo le indicazioni della ditta produttrice. 12. Conferma biochimica 12.1 Prova della citocromossidasi Prima di effettuare la prova è necessario selezionare, isolando per striscio, le colonie sospette su Agar soia triptone (10.2.1) ed incubare a 36±1°C per 24±2 ore. La prova permette di differenziare i microrganismi appartenenti al gruppo dei coliformi in base alla presenza dell’enzima citocromossidasi. I coliformi sono ossidasi-negativi. 13. Procedura Prelevare, con le usuali regole di asepsi, con un’ansa sterile la colonia cresciuta sul terreno di crescita e strisciare su una carta da filtro imbibita del reattivo (10.3.1) preparato al momento dell’uso o saggiare sui dischetti o con i tamponi adatti all’uopo distribuiti in commercio. Una reazione negativa (tipica dei coliformi fecali) si manifesta con il mancato sviluppo di colore, mentre i microrganismi ossidasi-positivi producono una reazione che fornisce una colorazione blu-violetto entro pochi secondi. 14. Espressione dei risultati Il numero di coliformi fecali isolati si calcola in base al numero di colonie contate, ed eventualmente sottoposte alla prova di conferma, considerando l’eventuale diluizione e riportando il valore come Unità Formanti Colonia per 100 mL di campione (UFC/100 mL). Dal numero di colonie caratteristiche contate sulla membrana e tenendo conto dei risultati delle prove di conferma, calcolare il numero di microrganismi presenti in 100 mL del campione in base alla seguente formula (1): A·N·Vs·F C = (1) B·Vt dove: C = numero di colonie che sono state confermate per 100 mL; A = numero di colonie confermate; B = numero di colonie da sottoporre a conferma; 880  METODI PER LA DETERMINAZIONE DI MICRORGANISMI INDICATORI D’INQUINAMENTO E DI PATOGENI N = numero di colonie caratteristiche contate sulla membrana; Vt = volume (mL) di campione analizzato; Vs = volume di riferimento per l’espressione dei risultati (100 mL); F = fattore di diluizione. 15. Resoconto di prova Il resoconto di prova deve indicare il metodo utilizzato ed esprimere i risultati come numero di microrganismi per volume di campione. Deve altresì indicare tutti i dettagli operativi, nonché qualsiasi inconveniente in grado di avere influenzato i risultati. BIBLIOGRAFIA APHA, AWWA, WEF (1998): “Standard Methods for examination of water and wastewater”, XX Ed., (Washington, APHA). GELDREICH E.E., CLARK H.F., HUFF C.B. & BEST L.C. (1965): “Fecal coliform organism medium for the membrane filter technique”, J. Am. Water Works Ass., 57, 208.  M E T O D I P E R L A D E T E R M I N A Z I O N E D I M I C R O R G A N I S M I I N D I C AT O R I D’INQUINAMENTO E DI PATOGENI 7030. Escherichia coli 1. Introduzione 1.1 Generalità Mentre le denominazioni “coliformi totali” e “coliformi fecali” fanno riferimento a gruppi eterogenei di batteri, il termine Escherichia coli corrisponde ad una specie tassonomicamente definita, a sua volta compresa nella famiglia delle Enterobatteriacee. Escherichia coli è un microrganismo a forma di bastoncello gram-negativo, aerobio ed anaerobio facoltativo, non sporigeno, che cresce alla temperatura di 44±1°C, lattosio-fermentante, indolo-positivo in terreni contenenti triptofano, ß-D-glucuronidasi-positivo. In letteratura, la presenza di questo enzima è stata evidenziata nel 94-99,5 dei biotipi di Escherichia coli,con l’eccezione dei sierotipi O157:H7, e anche, in bassa percentuale, in Shigella, Salmonella e Yersinia. L’enzima non è prodotto dai coliformi; conseguentemente il rilevamento della sua presenza può essere usato per discriminare Escherichia coli da questi ultimi. Per talune peculiari caratteristiche Escherichia coli sembra meglio soddisfare i requisiti insiti nella definizione di organismo indicatore, rispetto ai tradizionali indicatori di contaminazione fecale delle acque e già da tempo l’Organizzazione Mondiale della Sanità considera questa specie come indicatore primario di inquinamento di origine fecale. Tale scelta è motivata dalla maggiore stabilità della sua presenza nell’ambiente acquatico nel corso dell’anno rispetto ai coliformi, che risulterebbero più sensibili alle variazioni stagionali e, non di meno, dalla minore sensibilità del microrganismo alle procedure di disinfezione rispetto alla maggior parte dei patogeni enterici. Inoltre nell’ambito del gruppo dei coliformi, Escherichia coli è ampiamente rappresentato ed è in esclusivo rapporto con il tratto gastrointestinale dell’uomo e degli animali a sangue caldo. Con i metodi tradizionali, che ne consentono una diagnosi solamente presuntiva, la determinazione analitica di Escherichia coli ha necessariamente sempre comportato lo svolgimento di una serie di prove di conferma. Più di recente sono stati formulati substrati diversi da quelli tradizionali, modificati con l’aggiunta di composti cromogeni e fluorogeni che si basano sullo sfruttamento di attività enzimatiche specifiche. I dati, riportati in letteratura anche da altri autori e ricavati da esperienze di laboratorio svolte anche nell’ambito di circuiti interlaboratoriali europei, confermano la possibilità di evidenziare, con questi substrati, in modo selettivo, direttamente la specie ricercata, con rese equivalenti o superiori rispetto ai terreni convenzionali. 1.2 Obiettivo I metodi descritti consentono di valutare, in un determinato volume di acqua, la concentrazione di Escherichia coli mediante il calcolo statistico del Most Probable Number (MPN, numero più probabile) o con procedure di conta diretta. 1.3 Principio dei metodi Di seguito sono proposti diversi metodi per il rilevamento di Escherichia coli (Metodi A-F), tutti basati, non più sulla tradizionale reazione della fermentazione del lattosio, bensì sul rilevamento dell’attività enzimatica della ß-glucuronidasi, evidenziabile dall’idrolisi di ß-glucuronidi cromogeni o fluorogeni, con rilascio di composti colorati o fluorescenti. 883  METODI PER LA DETERMINAZIONE DI MICRORGANISMI INDICATORI D’INQUINAMENTO E DI PATOGENI 1.4 - Campo di applicazione Le procedure analitiche di seguito riportate possono essere utilizzate per l’analisi di acque superficiali, di fiume, di lago e per acque reflue anche sottoposte a trattamento. 2. METODO A Il metodo di seguito descritto corrisponde alla Norma ISO 9308-3: 1998. È applicabile all’analisi di tutti i tipi di acque superficiali e reflue, ed è particolarmente adatto all’esame diquelle ricche di materiale in sospensione. È di facile e rapido impiego. 2.1 Principio del Metodo A Il campione diluito è inoculato in 96 pozzetti da 350 µL contenenti il terreno di coltura disidratato. Dopo un periodo di incubazione di 36-72 ore a 44±1°C si procede alla lettura dei risultati sotto lampada a ultravioletti (366 nm). Escherichia coli, idrolizzando il 4-metilumbelliferil- ß-D-glucuronide (MUG), produce fluorescenza blu nei pozzetti. I risultati sono espressi come numero più probabile o Most Probable Number (MPN) per 100 mL di campione. 2.2 Volume da analizzare Per l’analisi è necessario determinare le diluizioni da inoculare in base alla tipologia e alla qualità dell’acqua da esaminare. In Tab. 1, per l’analisi di diverse tipologie di acque, vengono riportati il numero di diluizioni in funzione del livello di contaminazione presunto. 2.3 Strumentazione e vetreria Per lo svolgimento dell’analisi, dalla preparazione del terreno colturale alla lettura dei risultati, oltre alla normale attrezzatura di laboratorio sono necessari: -essiccatore; - lampada di Wood per l’osservazione a 366 nm; -micropipetta a 8 canali per l’inoculo di 200 µL; -nastro adesivo sterile; -piastre Petri; -piastre sterili a 96 pozzetti da 350 µL, non fluorescenti e a fondo piatto; -puntali sterili per micropipetta; -tubi per diluizioni. Superficiale marina 2 64 a 1:2 15-3,5 • 104 32 a 1:20 24 a 1:2 24 a 1:20 Superficiale dolce 4 24 a 1:200 40-3,2 • 106 24 a 1:2000 Reflua grezza 6 16 a 1:2 60-6,7 • 108 e trattata oltre 16 a 1:200000 Tipo di acqua N° di diluizioni Valori limite di misura N° batteri/100 mL N° di pozzetti/diluizione Tabella 1: Esempi di diluizione in funzione del livello di contaminazione delle acque  METODI PER LA DETERMINAZIONE DI MICRORGANISMI INDICATORI D’INQUINAMENTO E DI PATOGENI 2.4 Reattivi e terreni di coltura 2.4.1 MUG/EC Medium Composizione: Triptone Salicina Triton X 100 MUG Acqua distillata 40 1 1 100 1000 g g g mg mL Il terreno si trova in commercio disidratato e pronto per l’uso, già distribuito in piastre a 96 pozzetti corredate di nastro adesivo. Per la procedura di analisi, seguire le istruzioni della ditta produttrice. Qualora si proceda alla sua preparazione, a 1 L di acqua distillata aggiungere triptone, salicina e Triton (il Triton X 100 è uno dei prodotti utilizzabili, disponibili in commercio; possono comunque essere utilizzati prodotti equivalenti purché sia dimostrato forniscano gli stessi risultati), mantenendo in agitazione fino ad ebollizione e completa dissoluzione degli ingredienti. Raffreddare ed aggiungere il MUG disciolto in 2 mL di N,N-dimetilformamide. Aggiustare il pH a 6,9±0,2. Sterilizzare per filtrazione attraverso membrane con porosità nominale di 0,2 µm. Distribuire in aliquote da 100 µL in ciascuno dei 96 pozzetti in piastra. Disidratare immediatamente in un essiccatore o sotto cappa a flusso laminare. Nota: la N,N-dimetilformamide è tossica. Il prodotto può causare il cancro ed è nocivo per inalazione, contatto con la pelle e per ingestione. Il suo utilizzo richiede, da parte degli operatori, particolari precauzioni durante la manipolazione: protezione respiratoria (mascherina antipolvere e uso di cappa aspirante), protezione delle mani (guanti protettivi), protezione della pelle (indumenti protettivi). 2.4.2 Soluzione diluente Composizione: Acqua di mare sintetica 22,5 g Soluzione di blu di bromofenolo 10 mL Acqua distillata 1000 mL Miscelare gli ingredienti e sterilizzare in autoclave a 121±3°C per 15-20 minuti. Preparare la soluzione di blu di bromofenolo aggiungendo 0,04 g a 100 mL di etanolo al 50%. L’aggiunta di questa soluzione è facoltativa e utile solo per la colorazione della soluzione diluente. In alternativa alla soluzione diluente sopra indicata, possono essere utilizzati altri diluenti, quali acqua distillata, a meno che le stesse diluizioni preparate per il conteggio di Escherichia coli non debbano essere usate per il conteggio degli enterococchi intestinali. 2.4.3 Acqua distillata Utilizzare acqua distillata priva di sostanze inibenti la crescita nelle condizioni di prova. Sterilizzare l’acqua distillata a 121±3°C per 15-20 minuti. 2.5 Procedura 2.5.1 Preparazione delle diluizioni 885  METODI PER LA DETERMINAZIONE DI MICRORGANISMI INDICATORI D’INQUINAMENTO E DI PATOGENI 2.5.1.1 Acque con salinità <30‰ Aggiungere 9 mL di soluzione diluente (2.4.2) in tutti i tubi preparati in base al numero delle diluizioni prescelte. Agitare il campione per ottenere una distribuzione omogenea dei microrganismi e, usando una pipetta sterile, trasferire 9 mL del campione nel primo tubo contenente 9 mL di soluzione diluente (diluizione 1:2). Usando una nuova pipetta, dopo miscelazione, trasferire 1 mL della prima diluizione al secondo tubo (diluizione 1:20) e procedere allo stesso modo per le diluizioni successive. 2.5.1.2 Acque con salinità =30‰ Aggiungere 9 mL di acqua distillata sterile (2.4.3) nel tubo della prima diluizione e 9 mL di soluzione diluente (2.4.2) a tutti i tubi successivi preparati in base al numero delle diluizioni prescelte. Agitare il campione per ottenere una distribuzione omogenea dei microrganismi e, usando una pipetta sterile, trasferire 9 mL del campione nel primo tubo contenente 9 mL di acqua distillata (diluizione 1:2). Usando una nuova pipetta, dopo miscelazione, trasferire 1 mL della prima diluizione al secondo tubo (diluizione 1:20) e procedere allo stesso modo per le diluizioni successive. 2.5.2 Semina delle diluizioni e incubazione Con le adeguate regole di asepsi, versare la diluizione iniziale in una piastra Petri vuota sterile e, usando una micropipetta a 8 canali, distribuire 200 µL in ciascun pozzetto contenente il terreno disidratato (2.4.1), corrispondente alla prima diluizione. Operare in modo analogo per le diluizioni successive, cambiando la piastra Petri e i puntali ad ogni diversa diluizione. Coprire la piastra di inoculo con nastro adesivo sterile per prevenire contaminazioni esterne e disidratazione dell’inoculo. Incubare le piastre inoculate a 44±1°C per almeno 36 ore e fino ad un massimo di 72 ore. 2.5.3 Lettura dei risultati I pozzetti che sotto luce ultravioletta risultano blu-fluorescenti sono considerati positivi. 2.6 Espressione dei risultati Riportare il risultato ottenuto come valore MPN/100 mL di campione. Se nessuno dei pozzetti è positivo, esprimere il risultato come

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